11月11日晚上8點(diǎn)左右，Cell Research雜志以Letter to Editor形式在線發(fā)表了來自南通大學(xué)和復(fù)旦大學(xué)研究人員合作完成（該文通訊作者劉東博士和作者之一復(fù)旦大學(xué)王永明研究員）題為“NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish”的論文（下圖），該文結(jié)果表明 gDNA/NgAgo 系統(tǒng)在斑馬魚中能實(shí)現(xiàn)特定基因敲低導(dǎo)致魚眼部發(fā)育缺陷，但是不能對(duì)靶基因進(jìn)行基因編輯。

這篇文章中作者的研究的靶基因名為Fabp11a（Fatty acid binding protein 11a，脂肪酸結(jié)合蛋白11a），該基因在參與調(diào)解葡萄糖和脂代謝穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用，但是在斑馬魚胚胎發(fā)育中該基因的功能未知。對(duì)此，作者想知道NgAgo系統(tǒng)是否能在斑馬魚中工作，針對(duì)Fabp11a基因設(shè)計(jì)了兩條5'-磷酸化的ssDNA（下圖1），與優(yōu)化過的NgAgo-2nls mRNA一起注射到1細(xì)胞期的胚胎中，有趣的是他們觀察到注射過的胚胎中zui終約有30%會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的眼部發(fā)育表型。*類表型：眼部有一只相對(duì)小一點(diǎn)的眼睛而另一只顯得十分小；第二類表型：兩只眼睛融合形成一只較大的眼睛（見下圖2）。

圖一

圖二

為了證明是否斑馬魚出現(xiàn)的表型是由于Fabp11a基因遺傳突變?cè)斐傻?，作者抽提了正常斑馬魚胚胎和突變斑馬魚胚胎的DNA對(duì)靶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果測(cè)序結(jié)果表明靶基因沒有發(fā)生任何基因突變，但是通過RT-PCR檢測(cè)Fabp11a基因的表達(dá)驚奇的發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)有顯著敲低（見下圖E）。

為了更清楚的說明問題，作者進(jìn)一步做了一些實(shí)排除了單獨(dú)由NgAgo-2nls mRNA或者gDNA注射到胚胎導(dǎo)致的表型，而且同時(shí)注射NgAgo-2nls mRNA和錯(cuò)配的gDNA也不會(huì)產(chǎn)生表型，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明gDNA/NgAgo系統(tǒng)有其特異性。另外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明gDNA/NgAgo系統(tǒng)靶向敲低Fabp11a基因?qū)е碌陌唏R魚眼部的表型可以通過注射Fabp11a mRNA回復(fù)表型（見上圖D）。

為了進(jìn)一步確認(rèn)gDNA/NgAgo系統(tǒng)在斑馬魚中敲低基因是一種普遍的現(xiàn)象，作者又test的另外一個(gè)基因ta（no tail/ntl or brachyury），結(jié)果表明也有大約30%注射過的胚胎出現(xiàn)沒有尾巴的表型（見下圖）。

此前韓春雨NBT文章中表明gDNA/NgAgo系統(tǒng)在人源細(xì)胞（37℃）中能夠有效的產(chǎn)生11.2%-41.3% 的indels。Cell Res這篇文章中也在37℃的條件下檢測(cè)了斑馬魚中g(shù)DNA/NgAgo系統(tǒng)是否能產(chǎn)生indels，結(jié)果表明沒有檢測(cè)到任何indels發(fā)生。有趣的是在正常情況下，斑馬魚胚胎中注射gDNA和酶活突變的NgAgo mRNA也能產(chǎn)生系列表型，當(dāng)然同樣檢測(cè)不到任何indels的發(fā)生。為了再進(jìn)一步確認(rèn)斑馬魚的表型是由于Fabp11a敲低造成的，作者還做了一些后續(xù)的原位雜交實(shí)驗(yàn)，而且還運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除Fabp11a基因也能得到相似的表型，當(dāng)然基因敲除的表型顯然異常劇烈一些，有約10%的胚胎出現(xiàn)眼睛消失的表型。

總的來說，這項(xiàng)研究結(jié)果通過使用gDNA/NgAgo系統(tǒng)在斑馬魚中實(shí)現(xiàn)了特定基因的敲低，但是沒有檢測(cè)到靶基因上任何indels的出現(xiàn)，因?yàn)槊富钔蛔兊腘gAgo也能產(chǎn)生敲低的效果，作者猜測(cè)這個(gè)系統(tǒng)可能和酶活突變的Cas9：sgRNA系統(tǒng)類似都能在靶基因處抑制基因轉(zhuǎn)錄。

基因敲低（knockdown）和基因敲除（knockout）的區(qū)別

簡單說來，我們的生命活動(dòng)基本由蛋白質(zhì)作為機(jī)器來完成（RNA 的功能也正在越來越多地被發(fā)掘），根據(jù)中心法則“DNA-RNA-蛋白質(zhì)”zui簡化的套路，如果想抑制某個(gè)蛋白的功能，可以從 DNA、RNA、蛋白質(zhì)三個(gè)層面進(jìn)行調(diào)控。在DNA或者基因組水平的調(diào)控是zui*的，基因組編輯（genome editing）即對(duì)基因組上的目的基因進(jìn)行刪除、突變、或插入，歷*沿用至今的常用工具包括ZFN（鋅指蛋白酶）、TALEN 和 CRISPR。在RNA層面的編輯zui常用的是RNA干擾，通過抑制RNA的轉(zhuǎn)錄或者促進(jìn)RNA的降解從而降低RNA水平，影響其翻譯成蛋白質(zhì)以及相關(guān)性狀的發(fā)生，被稱為“敲低”（knockdown）。

knockdown（敲低）與knockout（敲除）是*不同的兩個(gè)概念。基因敲低是將基因表達(dá)水平下調(diào)，而不涉及靶基因 DNA 本身的變化，基本是不可遺傳的。基因敲除屬于基因（組）編輯技術(shù)，必須是在基因組水平上造成突變，破壞基因讀碼框，消除整個(gè)基因的表達(dá)。一般來說，在受精卵水平的基因編輯變化能夠穩(wěn)定地遺傳給下一代。敲低與敲除二者zui明顯的區(qū)別是基因組DNA序列是否發(fā)生變化。